VACINAS DE DNA E BIOSSEGURANÇA

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

Vasco Azevedo

Prof. Adjunto do Departamento de

Biologia Geral do Instituto de Ciências

Biológicas da Universidade Federal de

Minas Gerais- UFMG. Membro Titular da

CTNBio.

vasco@mono.icb.ufmg.br

Sérgio Costa Oliveira

Prof. Adjunto do Departamento de

Bioquímica e Imunologia do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade

Federal de Minas Gerais-UFMG. Membro

Titular da CTNBio.

scozeus@mono.icb.ufmg.br

Vacinas são administradas a pessoas sadias e, por isso, devem

ter um alto padrão de biossegurança.

As duas medidas de saúde pública

que tiveram maior impacto no controle

das enfermidades infecciosas e parasit

árias no mundo foram as de tratamento

da água e a vacinação, sendo a

segunda a que apresenta o melhor

custo-benefício. Há duzentos anos atrás,

Jenner criou uma nova era na medicina

quando intencionalmente infectou uma

criança com o vírus da varíola bovina.

Esse experimento, que hoje seria considerado

pela comunidade científica

como anti-ético, foi o começo para a

erradicação da primeira doença infecciosa

no mundo, a varíola humana

(Foto 1). Várias outras doenças e enfermidades

consideradas de maior gravidade

para a saúde humana estão sendo

controladas com vacinas tradicionais

ou de primeira geração (Tabela 1).

Apesar do sucesso dessas vacinas convencionais,

ainda existem muitas doen

ças que debilitam ou levam à morte,

como, por exemplo, a AIDS, a malária,

a dengue e a hepatite C, para as quais

não existem vacinas disponíveis ou as

que existem não são efetivas e apresentam

riscos inaceitáveis. Com o tremendo

avanço da biologia molecular,

que permite manipular, inserir e expressar

genes heterólogos em diferentes

organismos, novos tipos de vacinas

estão sendo desenvolvidas como alternativas

para o controle dessas enfermidades.

Dessas .vacinas recombinantes

. , a imunização genética ou vacina

de DNA é a mais promissora. Essa

tecnologia, de menos de uma década,

envolve a administração direta do DNA

plasmidiano carreando o gene codificador

da proteína antigênica, a qual

será expressa no interior da célula do

hospedeiro

nesta revista vários artigos

sobre o assunto (1-3) e na literatura

existe uma infinidade de exemplos

que demonstram a importância desse

novo instrumento na pesquisa biomé-

dica (4,5).

Vacinas são administradas a pessoas

sadias e, por isso, devem ter um alto

padrão de biossegurança. Os testes

clínicos das vacinas de DNA são similares

aos de outros produtos biológicos

(Tabela 2), sendo o seu controle de

qualidade mais fácil e menos oneroso

pois necessita apenas da certificação

da pureza do DNA. Contudo, existem

riscos potenciais de biossegurança,

como uma possível integração no genoma

da célula hospedeira do DNA

plasmidiano, que pode causar ativação

de oncogenes ou inibição de genes

supressores de tumor, e indução de

autoimunidade, que devem ser exaustivamente

investigados. Entretanto,

poucas evidências existem de que as

vacinas gênicas possam apresentar riscos

superiores aos desencadeados pelo

uso das vacinas convencionais (6).

Neste artigo, daremos ênfase ao tema

risco de integração do DNA vacinal no

genoma da célula hospedeira.

A integração do DNA plasmidiano

em cromossomos de células somáticas

pode potencialmente gerar efeitos patol

ógicos. A mutagênese por inserção

levaria a um câncer, caso esse evento

ative (proto-oncogenes) ou inative

genes (supressores de tumor) implicados

na regulação do ciclo celular. Essa

inserção pode ocorrer ao acaso ou por

meio da recombinação homóloga, sendo

que o primeiro evento seria o mais

freqüente. Para tentar diminuir a possibilidade

destes eventos ocorrerem,

deve-se evitar, se possível, que existam

seqüências nucleotídicas homólogas

ao do genoma humano no plasmí-

dio vacinal e que este não se replique

nas células hospedeiras. Plasmídios

usados na imunização genética possuem

uma estrutura com elementos regulat

órios como promotores, acentuadores,

terminadores, e sítios de poliadeniliza

ção reconhecidos pelas células

eucarióticas, marcadores de seleção,

que são, na maioria, antibióticos, e

uma origem de replicação que não é

funcional em células de mamíferos (7).

Apesar dos elementos regulatórios serem

funcionais nessas células, as seq

üências nucleotídicas desses plasmí-

dios não devem possuir homologias

significativas com o DNA genômico

. Recentemente, foram publicados

Foto cedida pelos autores

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

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dos mamíferos iguais ou superiores a

0,6 kilobases (kb), o que evitaria uma

maior eficiência na inserção do DNA,

ao acaso. Na recombina-

ção homóloga, além do

requisito anterior, os dois

genomas, o plasmidiano

e o do hospedeiro, devem

ser replicativos; como

os plasmídios mais utilizados

nas vacinas de DNA

não se replicam, a eficiência

desse evento ficaria

comprometida. Esses argumentos

teóricos são indicativos

de que a taxa de

integração é baixa, e se

esta ocorresse, a probabilidade

de mutação deveria

ser insignificante, e isso

foi comprovado pelos experimentos

pré-clínicos

realizados por Nichols e

colaboradores (8) e Martin e colaboradores,

(9) que utilizaram a técnica de

PCR (Polymerase Chain Reaction).

Como essa técnica é extremamente

sensível, foi necessário realizar algumas

adaptações para serem evitados

resultados falso positivos. Para que o

DNA genômico extraído de tecidos

musculares dos quadríceps dos camundongos

vacinados geneticamente

fosse separado do DNA plasmidiano

(vacina gênica), este foi digerido com

uma enzima rara, cujo sítio de clivagem

foi inserido no plasmídeo vacinal para

evitar a formação de concatâmeros,

eliminando uma migração em géis de

agarose conjunta com o DNA genômico.

Foram também tomados os clássicos

cuidados para evitar contamina-

ções na PCR, e, quando o resultado era

positivo, ou seja, havia a ocorrência do

evento de integração do plasmídeo no

genoma, foi necessário repetir os ensaios

com variantes da técnica de PCR,

como LMPCR ( Ligation-mediated-

PCR), ou PCR inversa, para a sua valida

ção. Nichols e colaboradores não

detectaram nenhuma evidência de integra

ção usando de 1 a 7,5 cópias de

plasmídeos por 150.000 células como

limite de sensiblidade, porém Martin e

colaboradores detectaram que entre 3-

30 cópias de plasmídeos ficavam associados

ao DNA genômico dos animais

vacinados. Apesar de resultados conflitantes

em relação à integração, a

conclusão dos dois grupos foi unânime

no cálculo de freqüência de muta-

ção induzida pela integração do plasm

ídeo no genoma do hospedeiro. A

probabilidade de uma mutação ocorrer

em um dado gene devido à imuniza

ção gênica, seria 3.000 vezes menor

do que a freqüência de mutação espont

ânea que ocorre no genoma das

células dos mamíferos. Entretanto,

Figura 1:

Foto da coleção do CDC (Center

for Disease Control and

Prevention) autorizada para

divulgação

Tabela 1. Datas da utilização em

seres humanos de vacinas de

primeira geração.

Homem com varíola.

Ano

1798

1885

1897

1923

1926

1927

1927

1935

1955

1962

1964

1967

1970

1981

Enfermidade

Varíola

Raiva

Peste bubônica

Difteria

Coqueluche

Tuberculose (BCG)

Tétano

Febre amarela

Poliomielite injétavel

Poliomielite oral

Sarampo

Papeira

Rubéola

Hepatite B*

De acordo com Plotkin & Mortiner

(15).

* Vacina de segunda geração

(proteina recombinante purificada

de células)

mesmo sendo a probabilidade tão

baixa para que eventos oncogênicos

ou patogênicos ocorram, somente um

longo período de avaliação

com um grande número de

voluntários permitiria determinar,

em seres humanos, a

ocorrência desses fenômenos

biológicos. O que significa

que os testes clínicos

são tão imprescindíveis para

as avaliações desses riscos

teóricos quanto para certificar

os benefícios potenciais

dessa nova tecnologia.

A agência reguladora

americana FDA (Food and

Drug Administration) agora

requer que testes com o uso

de PCR sejam feitos com as

adaptações descritas anteriormente

nos ensaios pré-

clínicos, mas ainda não estabeleceu

os níveis aceitáveis de integra

ção plasmidiana no genoma. Essa

mesma agência possui um documento

bem complexo que estabelece normas

para os experimentos em animais e

testes clínicos em humanos com a

utilização de vacinas de DNA (10) . Na

legislação brasileira de biossegurança,

ainda não existe uma instrução normativa

que seja específica e completa no

trato dessa matéria.

Testes clínicos na fase I e II em

seres humanos já estão sendo realizados

com vacinas de DNA contra as

seguintes enfermidades: AIDS, malá-

ria, linfoma das células B, melanoma,

hepatite B, e infecção pelo herpes

vírus. Calarota e colaboradores (11)

publicaram recentemente, na revista

.The Lancet., o resultado de testes

clínicos na fase I, onde indivíduos

imunizados com genes do HIV-1 induziram

resposta imune celular específica,

sem que efeitos colaterais tenham

sido observados. O grupo de Stephen

Hoffman (12), na fase I dos testes

clínicos com a vacina de DNA contra a

malária, relatou que a administração

foi bem tolerada, sem problemas de

biossegurança aparente e com uma

excelente indução da resposta celular.

Esses resultados deram suporte à passagem

para a fase II, onde serão feitos

testes de proteção contra essa enfermidade.

Nos tratamentos de câncer, as vacinas

de DNA estão sendo usadas em

pacientes quando os tumores são refra

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

Tabela 2.

Testes Clínicos

Fases

I

II

III

Número de pacientes

20 a 100

Algumas centenas

Algumas centenas até

alguns milhares

Tempo

Alguns meses

Alguns meses até 2 anos

Alguns meses até 2 anos

Avaliação da biossegurança

e efeitos colaterais

+++

+++

+++

Teste de proteção

+++

+++

O primeiro passo para uma vacina ser aprovada para comercialização é o teste em animais de laboratório; se esses

não apresentarem reações adversas, as etapas posteriores podem ser prosseguidas. O passo seguinte são testes

clínicos em seres humanos, que são divididos em três fases de avaliação do nível de proteção conferido por estas

vacinas e a sua biossegurança. Se nas últimas fases, for comprovada que essas vacinas são efetivas e seguras, então

a indústria farmacêutica pode solicitar aos órgãos competentes a licença para a comercialização do produto

tários às terapias tradicionais. Em

um desses testes clínicos, pacientes

com melanoma receberam injeções

de DNA complexados a lipossomos

diretamente nos tumores. Em alguns

desses pacientes houve regress

ão do tumor e de suas metástases

(13).

Os testes clínicos relatados anteriormente

foram realizados através

da injeção direta de DNA no músculo

do indivíduo ou nos tumores,

porém o teste com a vacina de DNA

contra a hepatite B foi realizado por

meio da imunização pelo processo

da biobalística, utilizando-se o .gene

gun. ou arma de genes (14). O .gene

gun. é um aparelho que promove a

aceleração e a introdução de micropart

ículas de ouro encobertas com o

DNA plasmidiano recombinante na

derme dos indivíduos. Os voluntários

vacinados não se queixaram de

dor ou de qualquer outro desconforto

devido à utilização desse aparelho.

Uma resposta eritematosa moderada

e transiente foi observada, o

que consiste em uma resposta inflamat

ória natural da pele após a imuniza

ção. Esse estudo demonstra que

essa via de administração das vacinas

de DNA, utilizando a arma de

genes .gene gun., pode viabilizar a

imunização de um grande número

de indivíduos quase que automatizando

esse processo.

As vacinas de DNA em menos de

uma década têm dado uma contribui

ção real no campo da vacinologia,

e possuem uma grande vantagem

em relação às vacinas tradicionais,

o que torna essa tecnologia um

instrumento importante no combate

às doenças infecciosas que afetam a

nossa sociedade.

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