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Biotecnologia Ciência & DesenvolvimentoVasco Azevedo
Prof. Adjunto do Departamento de
Biologia Geral do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de
Minas Gerais- UFMG. Membro Titular da
CTNBio.
vasco@mono.icb.ufmg.br
Sérgio Costa Oliveira
Prof. Adjunto do Departamento de
Bioquímica e Imunologia do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Minas Gerais-UFMG. Membro
Titular da CTNBio.
scozeus@mono.icb.ufmg.br
Vacinas são administradas a pessoas sadias e, por isso, devem
ter um alto padrão de biossegurança.
As duas medidas de saúde pública
que tiveram maior impacto no controle
das enfermidades infecciosas e parasit
árias no mundo foram as de tratamento
da água e a vacinação, sendo a
segunda a que apresenta o melhor
custo-benefício. Há duzentos anos atrás,
Jenner criou uma nova era na medicina
quando intencionalmente infectou uma
criança com o vírus da varíola bovina.
Esse experimento, que hoje seria considerado
pela comunidade científica
como anti-ético, foi o começo para a
erradicação da primeira doença infecciosa
no mundo, a varíola humana
(Foto 1). Várias outras doenças e enfermidades
consideradas de maior gravidade
para a saúde humana estão sendo
controladas com vacinas tradicionais
ou de primeira geração (Tabela 1).
Apesar do sucesso dessas vacinas convencionais,
ainda existem muitas doen
ças que debilitam ou levam à morte,
como, por exemplo, a AIDS, a malária,
a dengue e a hepatite C, para as quais
não existem vacinas disponíveis ou as
que existem não são efetivas e apresentam
riscos inaceitáveis. Com o tremendo
avanço da biologia molecular,
que permite manipular, inserir e expressar
genes heterólogos em diferentes
organismos, novos tipos de vacinas
estão sendo desenvolvidas como alternativas
para o controle dessas enfermidades.
Dessas .vacinas recombinantes
. , a imunização genética ou vacina
de DNA é a mais promissora. Essa
tecnologia, de menos de uma década,
envolve a administração direta do DNA
plasmidiano carreando o gene codificador
da proteína antigênica, a qual
será expressa no interior da célula do
hospedeiro
nesta revista vários artigos
sobre o assunto (1-3) e na literatura
existe uma infinidade de exemplos
que demonstram a importância desse
novo instrumento na pesquisa biomé-
dica (4,5).
Vacinas são administradas a pessoas
sadias e, por isso, devem ter um alto
padrão de biossegurança. Os testes
clínicos das vacinas de DNA são similares
aos de outros produtos biológicos
(Tabela 2), sendo o seu controle de
qualidade mais fácil e menos oneroso
pois necessita apenas da certificação
da pureza do DNA. Contudo, existem
riscos potenciais de biossegurança,
como uma possível integração no genoma
da célula hospedeira do DNA
plasmidiano, que pode causar ativação
de oncogenes ou inibição de genes
supressores de tumor, e indução de
autoimunidade, que devem ser exaustivamente
investigados. Entretanto,
poucas evidências existem de que as
vacinas gênicas possam apresentar riscos
superiores aos desencadeados pelo
uso das vacinas convencionais (6).
Neste artigo, daremos ênfase ao tema
risco de integração do DNA vacinal no
genoma da célula hospedeira.
A integração do DNA plasmidiano
em cromossomos de células somáticas
pode potencialmente gerar efeitos patol
ógicos. A mutagênese por inserção
levaria a um câncer, caso esse evento
ative (proto-oncogenes) ou inative
genes (supressores de tumor) implicados
na regulação do ciclo celular. Essa
inserção pode ocorrer ao acaso ou por
meio da recombinação homóloga, sendo
que o primeiro evento seria o mais
freqüente. Para tentar diminuir a possibilidade
destes eventos ocorrerem,
deve-se evitar, se possível, que existam
seqüências nucleotídicas homólogas
ao do genoma humano no plasmí-
dio vacinal e que este não se replique
nas células hospedeiras. Plasmídios
usados na imunização genética possuem
uma estrutura com elementos regulat
órios como promotores, acentuadores,
terminadores, e sítios de poliadeniliza
ção reconhecidos pelas células
eucarióticas, marcadores de seleção,
que são, na maioria, antibióticos, e
uma origem de replicação que não é
funcional em células de mamíferos (7).
Apesar dos elementos regulatórios serem
funcionais nessas células, as seq
üências nucleotídicas desses plasmí-
dios não devem possuir homologias
significativas com o DNA genômico
. Recentemente, foram publicadosFoto cedida pelos autores
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
47dos mamíferos iguais ou superiores a
0,6 kilobases (kb), o que evitaria uma
maior eficiência na inserção do DNA,
ao acaso. Na recombina-
ção homóloga, além do
requisito anterior, os dois
genomas, o plasmidiano
e o do hospedeiro, devem
ser replicativos; como
os plasmídios mais utilizados
nas vacinas de DNA
não se replicam, a eficiência
desse evento ficaria
comprometida. Esses argumentos
teóricos são indicativos
de que a taxa de
integração é baixa, e se
esta ocorresse, a probabilidade
de mutação deveria
ser insignificante, e isso
foi comprovado pelos experimentos
pré-clínicos
realizados por Nichols e
colaboradores (8) e Martin e colaboradores,
(9) que utilizaram a técnica de
PCR (Polymerase Chain Reaction).
Como essa técnica é extremamente
sensível, foi necessário realizar algumas
adaptações para serem evitados
resultados falso positivos. Para que o
DNA genômico extraído de tecidos
musculares dos quadríceps dos camundongos
vacinados geneticamente
fosse separado do DNA plasmidiano
(vacina gênica), este foi digerido com
uma enzima rara, cujo sítio de clivagem
foi inserido no plasmídeo vacinal para
evitar a formação de concatâmeros,
eliminando uma migração em géis de
agarose conjunta com o DNA genômico.
Foram também tomados os clássicos
cuidados para evitar contamina-
ções na PCR, e, quando o resultado era
positivo, ou seja, havia a ocorrência do
evento de integração do plasmídeo no
genoma, foi necessário repetir os ensaios
com variantes da técnica de PCR,
como LMPCR ( Ligation-mediated-
PCR), ou PCR inversa, para a sua valida
ção. Nichols e colaboradores não
detectaram nenhuma evidência de integra
ção usando de 1 a 7,5 cópias de
plasmídeos por 150.000 células como
limite de sensiblidade, porém Martin e
colaboradores detectaram que entre 3-
30 cópias de plasmídeos ficavam associados
ao DNA genômico dos animais
vacinados. Apesar de resultados conflitantes
em relação à integração, a
conclusão dos dois grupos foi unânime
no cálculo de freqüência de muta-
ção induzida pela integração do plasm
ídeo no genoma do hospedeiro. A
probabilidade de uma mutação ocorrer
em um dado gene devido à imuniza
ção gênica, seria 3.000 vezes menor
do que a freqüência de mutação espont
ânea que ocorre no genoma das
células dos mamíferos. Entretanto,
Figura 1:
Foto da coleção do CDC (Center
for Disease Control and
Prevention) autorizada para
divulgação
Tabela 1. Datas da utilização em
seres humanos de vacinas de
primeira geração.
Homem com varíola.Ano
1798
1885
1897
1923
1926
1927
1927
1935
1955
1962
1964
1967
1970
1981
Enfermidade
Varíola
Raiva
Peste bubônica
Difteria
Coqueluche
Tuberculose (BCG)
Tétano
Febre amarela
Poliomielite injétavel
Poliomielite oral
Sarampo
Papeira
Rubéola
Hepatite B*
De acordo com Plotkin & Mortiner
(15).
* Vacina de segunda geração
(proteina recombinante purificada
de células)
mesmo sendo a probabilidade tão
baixa para que eventos oncogênicos
ou patogênicos ocorram, somente um
longo período de avaliação
com um grande número de
voluntários permitiria determinar,
em seres humanos, a
ocorrência desses fenômenos
biológicos. O que significa
que os testes clínicos
são tão imprescindíveis para
as avaliações desses riscos
teóricos quanto para certificar
os benefícios potenciais
dessa nova tecnologia.
A agência reguladora
americana FDA (Food and
Drug Administration) agora
requer que testes com o uso
de PCR sejam feitos com as
adaptações descritas anteriormente
nos ensaios pré-
clínicos, mas ainda não estabeleceu
os níveis aceitáveis de integra
ção plasmidiana no genoma. Essa
mesma agência possui um documento
bem complexo que estabelece normas
para os experimentos em animais e
testes clínicos em humanos com a
utilização de vacinas de DNA (10) . Na
legislação brasileira de biossegurança,
ainda não existe uma instrução normativa
que seja específica e completa no
trato dessa matéria.
Testes clínicos na fase I e II em
seres humanos já estão sendo realizados
com vacinas de DNA contra as
seguintes enfermidades: AIDS, malá-
ria, linfoma das células B, melanoma,
hepatite B, e infecção pelo herpes
vírus. Calarota e colaboradores (11)
publicaram recentemente, na revista
.The Lancet., o resultado de testes
clínicos na fase I, onde indivíduos
imunizados com genes do HIV-1 induziram
resposta imune celular específica,
sem que efeitos colaterais tenham
sido observados. O grupo de Stephen
Hoffman (12), na fase I dos testes
clínicos com a vacina de DNA contra a
malária, relatou que a administração
foi bem tolerada, sem problemas de
biossegurança aparente e com uma
excelente indução da resposta celular.
Esses resultados deram suporte à passagem
para a fase II, onde serão feitos
testes de proteção contra essa enfermidade.
Nos tratamentos de câncer, as vacinas
de DNA estão sendo usadas em
pacientes quando os tumores são refra
48Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
Tabela 2.
Testes ClínicosFases
I
II
III
Número de pacientes
20 a 100
Algumas centenas
Algumas centenas até
alguns milhares
Tempo
Alguns meses
Alguns meses até 2 anos
Alguns meses até 2 anos
Avaliação da biossegurança
e efeitos colaterais
+++
+++
+++
Teste de proteção
+++
+++
O primeiro passo para uma vacina ser aprovada para comercialização é o teste em animais de laboratório; se esses
não apresentarem reações adversas, as etapas posteriores podem ser prosseguidas. O passo seguinte são testes
clínicos em seres humanos, que são divididos em três fases de avaliação do nível de proteção conferido por estas
vacinas e a sua biossegurança. Se nas últimas fases, for comprovada que essas vacinas são efetivas e seguras, então
a indústria farmacêutica pode solicitar aos órgãos competentes a licença para a comercialização do produto
tários às terapias tradicionais. Em
um desses testes clínicos, pacientes
com melanoma receberam injeções
de DNA complexados a lipossomos
diretamente nos tumores. Em alguns
desses pacientes houve regress
ão do tumor e de suas metástases
(13).
Os testes clínicos relatados anteriormente
foram realizados através
da injeção direta de DNA no músculo
do indivíduo ou nos tumores,
porém o teste com a vacina de DNA
contra a hepatite B foi realizado por
meio da imunização pelo processo
da biobalística, utilizando-se o .gene
gun. ou arma de genes (14). O .gene
gun. é um aparelho que promove a
aceleração e a introdução de micropart
ículas de ouro encobertas com o
DNA plasmidiano recombinante na
derme dos indivíduos. Os voluntários
vacinados não se queixaram de
dor ou de qualquer outro desconforto
devido à utilização desse aparelho.
Uma resposta eritematosa moderada
e transiente foi observada, o
que consiste em uma resposta inflamat
ória natural da pele após a imuniza
ção. Esse estudo demonstra que
essa via de administração das vacinas
de DNA, utilizando a arma de
genes .gene gun., pode viabilizar a
imunização de um grande número
de indivíduos quase que automatizando
esse processo.
As vacinas de DNA em menos de
uma década têm dado uma contribui
ção real no campo da vacinologia,
e possuem uma grande vantagem
em relação às vacinas tradicionais,
o que torna essa tecnologia um
instrumento importante no combate
às doenças infecciosas que afetam a
nossa sociedade.
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E Célio Silva explica porquê: "Atualmente, o isolamento de genes ou DNAs é uma técnica dominada pela ciência devido ao grande desenvolvimento da biologia molecular nos últimos anos. Os genes, freqüentemente relacionados com a virulência ou patogenia dos agentes infecciosos, são ligados a outros fragmentos de DNA, denominados 
No caso da tuberculose, a ativação de linfócitos e macrófagos, que são as principais células de defesa do nosso organismo, resulta na destruição de células que albergam os bacilos da tuberculose em seu interior, ao mesmo tempo que ajuda a eliminá-los do organismo. Portanto, os estudos realizados em nosso laboratório sobre a capacidade das proteínas antigênicas em estimular de maneira adequada o sistema imunológico; o padrão de secreção de mediadores imunológicos (substâncias que levam as mensagens entre os diferentes componentes do sistema imunológico); a atividade citotóxica das células de defesa (capacidade de destruir as células infectadas com os bacilos); e o estudo sobre as células que guardam na 'memória' as informações para o combate aos bacilos, foram de fundamental importância para se estabelecer como o sistema imunológico protege contra a tuberculose e permitiu o desenvolvimento da vacina".